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ELISA實驗中常見的問題
問題一:哪些樣本可用于ELISA實驗?
答:血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿、細胞裂解液、尿液、唾液、腦脊液等。不同的樣本類型有不同的處理方法。
1、血清:指血液凝固后，在血漿中除去纖維蛋白原及某些凝血因子后分離出的淡黃色透明液體或指纖維蛋白原已被除去的血漿。血清是 ELISA 實驗常用的樣本，其預處理也十分簡單。
使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置 2 小時或 4℃過夜，分離出血清(建議傾斜試管或離心管以擴大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來)。4℃下以1000×g 離心 20 分鐘，小心收集上清液(血清)，立即進行測定。建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復凍融。
在收集血液樣本的過程中應避免溶血，因為紅細胞在溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA 實驗中將會出現(xiàn)非特異性顯色反應，導致檢測結果不準確，出現(xiàn)假陽性結果。另外，樣本還應避免細菌污染，因為細菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會導致檢測結果不準確。
2. 血漿:是離開血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過離心沉淀，所獲得的不含細胞成分的液體。血漿與血清的主要區(qū)別在于血漿中含有纖維蛋白。
使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后 30 分鐘內(nèi)，4℃下以 1000×g離心 15 分鐘，小心收集上清液(血漿)。建議在-20℃或-80℃下將收集的血漿分裝保存，避免反復凍融。樣本應避免溶血或高血脂。常見的抗凝劑包括 EDTA(部分酶相關指標不建議使用)，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測前請仔細閱讀 ELISA 試劑盒說明書，查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。
3. 細胞培養(yǎng)上清:含有細胞分泌蛋白和死細胞的細胞培養(yǎng)液。
將細胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以 1000×g 離心 20 分鐘，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復凍融。
4. 細胞裂解液:經(jīng)細胞裂解液裂解后的細胞溶液。
(1)吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細胞沖洗干凈。 懸浮細胞可以省略該步驟。
(2)將細胞懸浮液收集到離心管中，以 1000×g 離心 10 分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預冷PBS 洗滌細胞 3 次。
(3)加入適量的預冷 PBS(建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。在 6 孔培養(yǎng)板中，每個孔 需要 150-250μL 的 PBS 來重懸細胞。
(4) 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復凍融，重復凍融過程數(shù)次，直至細胞裂解。也可 以使用超聲波細胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細胞。
(5) 4℃下以 10,000×g 離心 10 分鐘，去除細胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反復凍融。
5. 組織勻漿
(1) 用預冷的 PBS(0.01M，PH7.4)沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質(zhì)。
(2) 將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。
(3) 加入適量的預冷 PBS(體積取決于組織的重量，9 mL PBS 適用于 1 g 組織，建議使用前立即在 PBS 中加入適量蛋白酶抑制劑)，用玻璃勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。
(4) 將勻漿液吸入離心管中，4℃ 下以 5000×g 離心 5~10 分鐘，收集上清液，保存至-20℃或-80℃， 避免反復凍融。
一般來說，由于 ELISA 實驗只能檢測可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此要求樣本應清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實驗的準確性， -20℃或-80℃保存的樣本應在 1-6個月內(nèi)完成檢測，4℃保存的樣本在一周內(nèi)完成檢測。
問題二:ELISA法一般都能檢測血清、血漿和細胞上清嗎?
答:不能。原因主要從指標適應性和體系適應性2個方面來說明。
首先，我們要根據(jù)既往的研究和文獻報道確認，我們所檢測的靶標是否在血清、血漿中有正常表達，是否在疾病狀態(tài)，特殊生理時期，特定的生物鐘時會分泌表達，如果以上幾種情況都不存在，或者暫時沒有研究結果支持，那么使用血清或血漿檢測可能無信號值。另外，ELISA 方法并不是只能檢測分泌性靶標，某些靶標經(jīng)適當?shù)牧呀庾饔煤?，釋放出靶標蛋白的樣本同樣可以進行檢測，目前我們的產(chǎn)品中也有不少此類靶標。再說，細胞上清樣本。同樣的，需要根據(jù)既往的研究和文獻報道或者客戶的實驗設計確認，我們所檢測的靶標是否分泌到上清中，如果無研究和文獻支持，那么檢測可能無信號值。也就是不適合使用上清樣本檢測。
其次，我們使用的血清、血漿、細胞上清樣本屬于復雜基質(zhì)的樣本，常常混合了其他與靶標蛋白可能發(fā)生結合的或者多種非特異性物質(zhì)造成的對檢測靶標蛋白的干擾，也就是基質(zhì)效應。那么我們的 ELISA 產(chǎn)品要適應這樣的情況，則需要使用適當?shù)纳a(chǎn)體系和測試體系來解決這樣的問題。這就是我們的檢測體系從外觀看都一樣，但是實際成分不一樣的原因。當體系不合適時，可能存在嚴重的基質(zhì)效應無法消除，從而干擾測試的準確性。也就是為何，有的產(chǎn)品只能檢測血清、血漿，有的產(chǎn)品只能檢測細胞上清了。
問題三:為什么要做預實驗?
答:通過預實驗可以確定樣本的大致濃度范圍，防止樣本濃度過高或者過低得不到較好的結果，同時也可以節(jié)約樣本和試劑盒。
問題四:預實驗做過標曲，正式實驗還需要做標曲嗎?
答:需要。原因是避免出現(xiàn)樣本全陰性時無陽性對照。
問題五:怎么解釋樣本越稀釋濃度值越高?
答:一種原因是樣本受基質(zhì)效應的影響。通過剃度稀釋可以消除基質(zhì)的影響，稀釋過后的樣本濃度會出現(xiàn)先升高再下降的趨勢。
另一種原因是樣本受藥物的影響。
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