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產(chǎn)品描述

        HRbio™ miRNA qPCR Kit采用 SYBR Green I嵌合熒光法的原理進(jìn)行miRNA的熒光定量檢測(cè)。本產(chǎn)品包含miRNA qPCR所需要的所有試劑，組分分別是：2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer。其中2×miRNA qPCR Mix（含SYBR Green）是專門(mén)為miRNA熒光定量檢測(cè)而特別研發(fā)的新一代預(yù)混液形式的qPCR試劑。其中DNA polymerase采用的是抗體修飾的熱啟動(dòng)形式，配合特殊的buffer體系，使得反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并且在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

qPCR系列 蛋白與免疫熒光定量PCR試劑盒 產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

1.-20°C 避光保存至少 12 個(gè)月，使用前充分融解混勻。

2.2 ×miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)短期使用可放在 4°C，避免反復(fù)凍融。

3.Reverse primer(10μM )每次用完置-20°C 保存。

注意事項(xiàng)

1.miRNA 第一鏈cDNA 的加入量不要超過(guò)real time PCR 體積1/10。

2.對(duì)于特殊的檢測(cè)體系中，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所檢測(cè)miRNA 的豐度適當(dāng)?shù)南♂宑DNA（5-10倍或者100倍）。

3.本品中含有熒光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反應(yīng)液時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。

4.2 x miRNA qPCR Mix不含參比染料ROX，客戶并根據(jù)qPCR儀器技術(shù)指導(dǎo)決定是否需要加ROX參比染料，用于消除信號(hào)本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差

5.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

6.本產(chǎn)品僅作科研用途！

操作步驟

1. 在室溫融化2 ×miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。

2. 使用時(shí)請(qǐng)將2 ×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經(jīng)輕微離心后使用。如果試劑沒(méi)有混勻，其反應(yīng)性能會(huì)有所下降。注：請(qǐng)不要使用振蕩器混勻。

3. 按照下表組分冰上進(jìn)行反應(yīng)液的配制：

【注】： 使用前務(wù)必充分混勻， 避免劇烈震蕩產(chǎn)生過(guò)多氣泡。

a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據(jù)情況在0.1- 1.0 μM之間進(jìn)行調(diào)整。

b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應(yīng)超過(guò)qPCR反應(yīng)總體積的1/10。

c) 模板稀釋：cDNA原液建議5- 10倍稀釋，最佳模板加入量以擴(kuò)增得到的CT值在20-30個(gè)循環(huán)為好。

d) 反應(yīng)體系：推薦使用20μL或50 μL ，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。

e) 體系配制：請(qǐng)于超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，并使用無(wú)核酸酶殘留的槍頭、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。

 qPCR系列 蛋白與免疫熒光定量PCR試劑盒

PCR 循環(huán)（三步法）

PCR 循環(huán)（二步法）

【注】高特異性可選擇兩步法，高效率擴(kuò)增可選擇三步法。

a)  預(yù)變性時(shí)間： 根據(jù)不同模板和引物的具體情況可適當(dāng)縮短至 2 min。

b)  退火溫度和時(shí)間：請(qǐng)根據(jù)引物和目的基因的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整。

c)  熒光信號(hào)采集（★）：請(qǐng)按照儀器使用說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置，幾種常見(jiàn)儀器的時(shí)間設(shè)定如下：

30sec 以上： Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec 以上：Applied Biosystems: 7300

34sec 以上： Applied Biosystems: 7500

d)  熔解曲線： 通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。